深圳真瑞生物科技有限公司
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产品编号：CP006 检测方法：荧光PCR 检测样品：口，鼻拭子 规格：25T/50T
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【产品名称】
通用名称：猫杯状病毒检测试剂盒（实时荧光PCR法）
英文名称：Feline Calic Virus Detection Kit (Real-Time PCR Method)
【包装规格】 25T/盒 & 50T/盒
【预期用途】
本试剂盒适用于猫杯状病毒检测，不进行病毒分型，可用于临床猫杯状病毒感染的辅助诊断，但不作确诊使用。
【检验原理】
本试剂盒针对猫杯状病毒基因组高度保守区域设计特异性引物和探针，在反应体系中含猫杯状病毒基因组模板的情况下，PCR反应得以进行并释放荧光信号。利用荧光定量PCR仪对PCR过程中相应通道信号进行实时监测和输出，实现检测结果的定性分析。
【主要组成成份】
序号 | 组成 | 25T /盒 | 50T /盒 |
1 | FCV RT-PCR反应液及酶混合液 | 20 μL×25管 | 20 μL×50管 |
2 | FCV 阴性对照 | 40 μL×1管 | 40 μL×1管 |
3 | FCV 阳性对照 | 40 μL×1管 | 40 μL×1管 |
4 | 说明书 | 1份 | 1份 |
注：阴性对照为猫基因组DNA，阳性对照为失去活性的猫杯状病毒cDNA。
【储存条件及有效期】避光-20℃以下保存，避免反复冻融，有效期12个月。
【适用仪器】ABI 系列、Bio-Rad系列、Agilent Stratagene MX系列 、Roche LightCycler R480、Cepheid SmartCycler、Rotor-Gene系列、杭州博日系列等多通道实时荧光定量PCR仪。
【样本要求】
1.样品取鼻拭子、口腔溃疡面拭子、结膜拭子，采集方法如下：
(1) 鼻拭子：将棉签轻轻插入鼻道内鼻腭处，停留片刻后缓慢转动退出。以同一拭子拭两侧鼻孔。将棉签浸入2-4 ml采样液中，尾部弃去。
(2) 口腔溃疡面拭子：用棉签擦拭舌、硬腭、腭中裂周围，同样将棉签头浸入2-4 ml采样液中，尾部弃去。
(3) 结膜拭子：用棉签擦拭眼周围分泌物，同样将棉签头浸入2-4 ml采样液中，尾部弃去。
2.血液或血清样品：使用无菌注射液抽取样品置于离心管中待检。
3.肺脏、脾脏、淋巴结等组织样品：取少量样品（2~3克）于研钵或匀浆器中研磨，然后将研磨匀浆转入无菌离心管中，3000rpm/min离心10分钟取上清待检。
4.应避免标本间交叉污染。
【检验方法】
1. 试剂准备（试剂准备区）
a.计算当次实验所需要的反应数，从-20℃以下冰箱保存的试剂盒中取等量8联PCR反应管（内装有PCR反应液）,平衡至室温；预留一管作为阴性对照一管作为阳性对照。
b.将实验所需的8联PCR反应管转移至样本处理区。
2.样本准备（样本处理区）
用QIAGEN、Roche公司RNA提取试剂盒提取RNA，具体操作按照其试剂盒说明书操作。
3.加样
a.取出8联PCR反应管试剂，瞬时离心以去除管壁附着液体。
b.打开反应管管盖，在液封层上（切勿插入底部）加入5 μL处理好的样本重悬液；阴性对照和阳性对照管则各加5 μL阴性对照或阳性对照品；
c.盖好PCR反应管盖，瞬时离心以去除管壁附着液体。
d.记录模板加样顺序。将PCR反应管转移到PCR扩增区进行PCR检测。
4.PCR（PCR扩增区）
（1）取样本处理区准备好的PCR反应管，放置在实时荧光定量PCR仪样品槽相应位置，并记录放置顺序。
（2）按下表设置仪器核酸扩增相关参数进行PCR扩增。
反应体积 | 25 μL | 通道选择 | FAM通道FCV荧光信号 |
PCR 反应 条件 | 步骤 | 条件 | 循环数 |
反转录 | 42℃：10分钟（min） | 1 | |
预变性 | 95℃：3分钟（min） | 1 | |
预扩增 | 95℃：5秒（s） | 5 | |
55℃：40秒（s） | |||
PCR扩增 | 95℃：5秒（s） | 40 | |
55℃：40秒（s） （此阶段结束时采集荧光信号） |
注：ABI系列荧光PCR仪在设置时不选ROX校正，设置淬灭基团选择None。
【参考值（参考范围）】
1.试剂盒有效性判定：
（1）阳性对照：有典型S型扩增曲线或Ct值≤35。
（2）阴性对照：Ct值＞38或无Ct值，线形为直线或轻微斜线，无指数增长期。
2.标本结果判定：
（1）阳性：标本检测结果Ct值≤35或有明显指数增长期。
（2）可疑：标本检测结果Ct值在35～38范围内。此时应对标本进行重复检测，如重复实验结果Ct值仍在35～38范围内，有明显指数增长期，则判定为阳性，否则为阴性。
（3）阴性：标本检测结果Ct值＞38或无Ct值。
【检验结果的解释】
通道及检测结果 | 标本检测结果解释 |
FAM | |
+ | 标本中检出FCV病毒RNA |
- | 标本中未检出FCV病毒RNA |
【检验方法的局限性】
1. 当检测样本中被检核酸浓度低于本试剂盒的最低检出限时可能会发生假阴性的结果。
2. 被检样本在采集、运输、储存以及处理过程中操作方式不当容易造成RNA降解而产生假阴性结果。
3. 样本在采集、运输、储存以及处理过程中发生交叉污染，则容易得到假阳性结果。
【产品性能指标】 产品的最低检出限为102 Copies/mL，产品CV值≤5%。
【注意事项】
1. 整个检测过程应严格按照本说明书要求分别在试剂准备区、样本处理区和PCR扩增区进行操作，各区实验服、仪器、耗材应独立使用，不能混用；实验用吸头采用带滤芯吸头；样本处理区应配有生物安全柜，样本处理在生物安全柜中进行操作；三个区应该配有紫外线杀菌装置。
2. 为避免RNA降解，样本处理过程应在0-4℃条件下操作，且完成实验后立即上机检测；样本处理过程中使用的器具耗材应经过无核酶处理。
3. 每次实验应该设置阴、阳性对照。
4. 试剂盒所有试剂在使用前应该在常温下充分融化混匀，并应瞬时离心。
5. 试剂盒内所配阴性和阳性对照在第一次使用前应全部转移至标本准备区，并单独存放。
6. 为防止荧光干扰，应避免裸手直接接触PCR反应管，并应避免在PCR反应管上进行任何标记。
7. 仪器扩增相关参数应按照本说明书相关要求进行设置；不同批号试剂不能混用。
8. ABI系列荧光定量PCR仪参数设置中不选ROX校正，淬灭基因选择None。
9. 实验过程中产品的废弃物应该进行无害化处理后方可丢弃。
