深圳真瑞生物科技有限公司
地址：深圳市龙华区清宁路1号电话：0755-26582639
24小时服务热线：13823103363
|
产品编号：SP008 检测方法：荧光PCR 检测样品：眼，鼻式子 规格：25T/50T
|
|
【产品名称】
通用名称：猫疱疹病毒I型检测试剂盒（实时荧光PCR法）
英文名称：Feline Herpesvirus I Detection Kit (Real-Time PCR Method)
【包装规格】 25T/盒 & 50T/盒
【预期用途】
猫疱疹病毒I型病（Feline Herpesvirus I,FHV-1）,又叫猫鼻气管炎病毒是由猫疱疹病毒I型（FHV-1）引起的猫呼吸道感染等疾病。本试剂盒利用实时荧光PCR原理，主要用于猫疱疹病毒I型的定性筛查检测及疗效评估有重要指导意义。
【检验原理】
本试剂盒针对猫疱疹病毒I型基因设计特异性引物和分子信标探针，在待检样本中含有猫疱疹病毒I型DNA的情况下，PCR反应得以进行并释放荧光信号。利用仪器对PCR过程中相应荧光信号进行实时监测和输出，实现检测结果的定性分析。
【主要组成成份】
序号 | 组成 | 25T/盒 | 50T/盒 |
1 | FHV-1 PCR反应液及混合酶液 | 20 μL×25管 | 20 μL×50管 |
2 | FHV-1 阴性对照 | 40 μL×1管 | 40 μL×1管 |
3 | FHV-1 阳性对照 | 40 μL×1管 | 40 μL×1管 |
4 | 说明书 | 1份 | 1份 |
注：阴性对照为不含猫疱疹病毒I型的其它菌的混合物，阳性对照为灭活的猫疱疹病毒I型。
【储存条件及有效期】避光-20℃以下保存，避免反复冻融，有效期12个月。
【适用仪器】ABI 系列、Bio-Rad系列、Agilent Stratagene MX系列、Roche LightCycler R480、Cepheid SmartCycler、Rotor-Gene系列、杭州博日系列等多通道实时荧光定量PCR仪。
【样本要求】
1. 采集猫的咽喉拭子、眼睛、鼻分泌物或溃疡伤口等作为样本，咽喉拭子用少量生理盐水浸润后取上清待检；其他样品加等体积生理盐水研磨匀浆，3000 g离心15 min，收集上清待检
2. 如需在增菌后进行PCR检测，则应使用选择性增菌液对原始标本进行增菌。
3. 标本收集后若不能立即检测，可置于2～8℃冷藏过夜保存；如需长期保存，标本应冻存于-20℃～-80℃。
【检验方法】
1. 试剂准备（试剂准备区）
a.计算当次实验所需要的反应数，从-20℃以下冰箱保存的试剂盒中取等量8联PCR反应管（内装有PCR反应液及混合酶液）,平衡至室温；预留一管作为阴性对照一管作为阳性对照。
b.将实验所需的8联PCR反应管转移至样本处理区。
2.样本准备（样本处理区）
用QIAGEN、Roche公司DNA提取试剂盒提取DNA，具体操作按照其试剂盒说明书操作。或按以下方法操作：
a.取试剂准备区传递过来的DNA提取液，2000 rpm 离心10 s后备用。
b.取样本自然沉降后的上清液1 mL，加入到1.5 mL无菌离心管中，12000 rpm离心5 min后，吸干上清，保留沉淀。
c.每管沉淀中加入DNA提取液50 μL，将沉淀悬浮后100℃加热处理5 min。
d.12000 rpm离心2 min，取上清用于PCR检测。
3.加样
a.取出8联PCR反应管试剂，瞬时离心以去除管壁附着液体。
b.打开反应管管盖，在液封层上（切勿插入底部）加入5 μL处理好的样本重悬液；阴性对照和阳性对照管则各加5 μL阴性对照或阳性对照品；
c.盖好PCR反应管盖，瞬时离心以去除管壁附着液体。
d.记录模板加样顺序。将PCR反应管转移到PCR扩增区进行PCR检测。
4.PCR（PCR扩增区）
（1）取样本处理区准备好的PCR反应管，放置在实时荧光定量PCR仪样品槽相应位置，并记录放置顺序。
（2）按下表设置仪器核酸扩增相关参数进行PCR扩增。
反应体积 | 25 μL | 通道选择 | FAM通道采集猫疱疹病毒I型荧光信号 |
PCR 反应 条件 | 步骤 | 条件 | 循环数 |
UNG处理 | 50℃：2分钟（min） | 1 | |
预变性 | 95℃：3分钟（min） | 1 | |
预扩增 | 95℃：5秒（s） | 5 | |
55℃：40秒（s） | |||
PCR扩增 | 95℃：5秒（s） | 40 | |
55℃：40秒（s） （此阶段结束时采集荧光信号） |
注：ABI系列荧光PCR仪在设置时不选ROX校正，设置淬灭基团选择None。
【参考值（参考范围）】
1.试剂盒有效性判定：
（1）阳性对照：有典型S型扩增曲线或Ct值≤35。
（2）阴性对照：Ct值＞38或无Ct值，线形为直线或轻微斜线，无指数增长期。
2.标本结果判定：
（1）阳性：标本检测结果Ct值≤35或有明显指数增长期。
（2）可疑：标本检测结果Ct值在35～38范围内。此时应对标本进行重复检测，如重复实验结果Ct值仍在35～38范围内，有明显指数增长期，则判定为阳性，否则为阴性。
（3）阴性：标本检测结果Ct值＞38或无Ct值。
【检验结果的解释】
通道及检测结果 | 标本检测结果解释 |
FAM | |
阴性（－） | 标本中未检出猫疱疹病毒I型 |
阳性（＋） | 标本中检测出猫疱疹病毒I型 |
【检验方法的局限性】
1. 当检测样本中被检核酸浓度含量低于本试剂盒的最低检出限时可能会发生假阴性的结果。
2. 本试剂盒仅供标本初步筛查使用，对于本试剂盒检测阳性结果应进一步使用培养法进行确诊。
【产品性能指标】 产品的最低检出限为102CFU，产品CV值≤5%。
【注意事项】
1. 整个检测过程应严格按照本说明书要求分别在试剂准备区、样本处理区和PCR扩增区进行操作，各区实验服、仪器、耗材应独立使用，不能混用；实验用吸头采用带滤芯吸头；样本处理区应配有生物安全柜，样本处理在生物安全柜中进行操作；三个区应该配有紫外线杀菌装置。
2. 每次实验应该设置阴、阳性对照。
3. 为保证试剂不受标本污染，必须将DNA提取液、混合酶液及PCR反应液保存于试剂准备区。
4. 试剂盒所有试剂在使用前应该在常温下充分融化混匀，并应瞬时离心。
5. 试剂盒内所配阴性和阳性对照在第一次使用前应全部转移至标本准备区，并单独存放。
6. 为防止荧光干扰，应避免裸手直接接触PCR反应管，并应避免在PCR反应管上进行任何标记。
7. 仪器扩增相关参数应按照本说明书相关要求进行设置；不同批号试剂不能混用。
8. ABI系列荧光定量PCR仪参数设置中不选ROX校正，淬灭基因选择None。
9. 实验过程中产品的废弃物应该进行无害化处理后方可丢弃。
