深圳真瑞生物科技有限公司
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产品编号：AP0002 检测方法：实时荧光PCR 检测样品：多样品 规格：40T
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非洲猪瘟病毒微流控荧光PCR快速检测试剂盒
LabChip Ultra Fast Fluorescence PCR Detection Kit for African Swine Fever Virus
【预期用途】
非洲猪瘟（African swine fever, ASF）是由非洲猪瘟病毒（ASFV）引起猪的一种急性、热性、高度接触性动物传染病，临床上以高热、网状内皮系统出血和高死亡率为特征，易感猪群的病死率高达100%。我国将其列为一类动物疫病，世界动物卫生组织（OIE）将其列为法定报告动物疫病，并且列入《禁止生物武器公约》核查动物病原体清单。
本试剂盒用于对样品中的非洲猪瘟 DNA 进行快速定性检测，可用于该病毒感染的实验室诊断和现场检测。检测结果仅供临床参考，不能单独作为确诊或排除病例的依据。实验操作人员应接受过基因扩增或分子生物学方法检测的专业培训，具备相关的实验操作资格。
【检测原理】
本试剂盒利用实时荧光PCR技术，以非洲猪瘟病毒基因组的高度保守区为靶区域，设计特异性引物及探针，探针标记FAM荧光素，配以Taq DNA 聚合酶等成分，使用配套的极速荧光PCR设备进行 PCR扩增，从而对样品中非洲猪瘟病毒DNA 进行快速定性检测。
【主要组成成份】
试剂名称 | 规格 |
1300µl×1管 | |
样本处理液B | 1300µl×1管 |
DNA聚合酶 | 20μL×1管 |
PCR反应液 | 280μL×1管 |
阴性对照 | 200μL×1管 |
阳性对照 | 200μL×1管 |
注：不同批号试剂盒的成份不可以互换使用。
【包装规格】
40头份/盒
【储存条件及有效期】
试剂于-20℃储存；反复冻融不超过 5 次；有效期12个月。
【适用仪器】
ZR-LC16/ V280 / UF-150型微流控极速荧光定量PCR仪。
【样品要求】
1.适用标本类型：血液、组织、血粉、饲料等。
2.标本采集与处理
（1）血液样品：用EDTA抗凝采血管采集血液，充分混匀，编号备用。
（2）组织样品：用无菌剪刀和镊子剪取病死或剖杀猪主要脏器（淋巴结、脾脏、扁桃体）约2g，加入10倍体积PBS或生理盐水，于研钵或组织匀浆器中充分研磨后转入1.5 mL离心管中编号备用。
（3）血粉：同上处理，只不过省掉研磨步骤。
（4）饲料等其它样品：参照专用的商品化提取试剂盒的说明书操作。
3.样本的储存
样品可立即用于检测，如不能立即检测，在 4℃保存不超过 24 小时，-20℃保存不超过3个月，-70℃可长期保存，反复冻融不超过 5 次。
【检测方法】
一、病毒DNA的提取
（1）待检样品份数总和用n表示 ，取n个灭菌的离心管，逐管编号。
（2）每管加入处理液A 30µl。
（3）每管分别加入已处理的待检样品3µl，充分混匀，18-25℃处理5分钟，旋涡震荡30秒。
（4）每管加入处理液B 30µl，震荡混匀，待检。
（5）处理后的样本如在2小时内进行下一步试验，请于4℃保存，如不能立即进行下一步试验，请于-20℃保存。
备注：饲料等其它样品，此步骤同样参照专用的商品化提取试剂盒的说明书操作。
二、PCR试剂配置（在试剂准备区进行）及加样（在样品处理区进行）。
1. 在试剂准备区，按下列组成配制PCR 混合液（n为待测样本数+1阳性对照+1阴性对照）：
试剂名称 | n份用量（10µl体系） |
PCR反应液 | 7µl×n |
DNA聚合酶 | 0.5×n |
（注意：使用前确保PCR反应液和DNA聚合酶充分融化）
2. 将PCR混合液按7µl/管 分装至PCR反应管中，并移至样品处理区。
3. 用带滤芯的吸嘴分别取已处理好的样品、阴性对照、阳性对照各3μl分别加到装有 PCR混合液的反应管中漩涡混匀、瞬时离心。
4. 使用UF-150型号的仪器，各取 10µl 加入PCR 扩增芯片中，盖上芯片膜，移至扩增检测区。
使用V280、ZR-LC16型号的仪器，各取 8µl 加入PCR 扩增芯片中，盖上芯片盖，移至扩增检测区。
三、PCR扩增检测（在扩增检测区进行）
1. 将PCR 芯片插入微流控极速荧光定量PCR仪中进行扩增检测。
2. 循环参数设定：
步 骤 | 循环数 | 温 度(℃) | 时 间(min:sec) | 收集荧光 信号 |
1 | 1 | 95 | 01:00 | 否 |
2 | 40 | 95 | 00:07 | 否 |
60 | 00:14 | 是 |
3. 仪器检测通道选择：荧光信号选择FAM 通道。
四、质控标准
1. 阴性对照：结果为阴性。
2. 阳性对照：结果为阳性，阳性对照 Ct 值≤33。
3. 以上两项需在一次实验中同时满足，否则，本次实验无效，实验应重新进行。
五、结果分析
1. 实验结束后，根据相关仪器的软件进行分析，调节噪声容限至基线噪声以上，使阴性对照 Ct 值不出现任何数值。
2. 阈值设定原则以阈值线刚好超过正常阴性对照曲线（无规则的噪音线）的最高点为准。
3. 记录仪器自动分析计算出的样品 Ct 值。
【临界值】本试剂盒的临界值为Ct值= 38。
【检测结果的解释】
1. 每次实验均需将试剂盒内的阴性对照、阳性对照与待检样品一同检测，检测结果应符合其性能指标，否则本次实验无效。
2. 实验结果判断方法
2.1阴性结果判定：如果样品在 FAM 通道扩增曲线均不呈 S 型、Ct 值为 UNDET 或者＞38.00。
2.2.阳性结果判定：如果样品在 FAM 通道扩增曲线呈S 型且Ct 值≤38，则结果为阳性。
3. 在质控正常的前提下，实验结果判读模式
3.1阳性样品报告格式为：样品检测到非洲猪瘟病毒DNA，浓度高于试剂盒的检测限；
3.2阴性样品报告格式为：样品未检测到非洲猪瘟病毒DNA，浓度低于试剂盒的检测限。
